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Sanger

La secuenciación Sanger se considera la técnica gold standard para la identificación de mutaciones puntuales y pequeñas INDELs. Consiste en el análisis de toda la secuencia codificante de un gen concreto. El diseño que Imegen realiza para este tipo de estudio permite el análisis de la secuencia de todas las regiones codificantes (exones) de cada gen, teniendo en cuenta todos los transcritos relevantes descritos en las bases de datos. En el estudio se incluyen además las regiones intrónicas adyacentes a cada exón, así como regiones 5’ y 3’, con la intención de identificar variaciones en regiones reguladoras o de procesado.

NextGeneDX

Imegen ha desarrollado NextGeneDx®. Se trata de una estrategia diagnóstica basada en NGS que utiliza una tecnología de diseño propio basada en la captura de las regiones de interés específicas mediante PCR. Sus características técnicas y su validación continua por comparación con la secuenciación de Sanger (gold standard), permiten garantizar la representatividad completa de las regiones de interés, así como la máxima sensibilidad y especificidad diagnósticas. La creación de librerías mediante PCR resuelve las limitaciones que muestran otros sistemas como el de captura por hibridación, en el que existen regiones de interés poco o nada representadas con profundidades de lectura sub-óptimas. Sus características técnicas principales son:

• Cobertura 100% de todas las regiones genómicas de interés, fundamentalmente exones y regiones intrónicas adyacentes.
• Profundidad de lectura mínima de 100X lo que permite obtener una sensibilidad y especificidad comparable a Sanger.

Arrays

Expansiones

Esta técnica consiste en la amplificación y determinación del número de repeticiones y su comparación con los rangos clínicos establecidos para cada patología. Para la amplificación se utiliza la PCR, long-PCR o TP-PCR (Triplet repeat primed PCR) en función de las características o tamaño de las expansiones.

PCR a tiempo real

Consiste en un análisis mediante PCR que permite amplificar y simultáneamente cuantificar el producto de dicha PCR. Para ello, se basa en el fundamento de la PCR convencional, pero utiliza un fluoróforo que permitirá medir la cantidad de amplificado a tiempo real.

MLPA

La técnica MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) se realiza para analizar patologías en las que se ha descrito la presencia de grandes deleciones, duplicaciones o reordenamientos que afectan a uno o varios exones del gen, o incluso al gen completo. Este tipo de mutaciones no suelen detectarse mediante secuenciación del ADN.

Esta técnica está basada en una PCR multiplex que permite cuantificar la dosis de determinadas regiones o exones por comparación con regiones de referencia. En la actualidad existe una amplia gama de kits comerciales para análisis mediante MLPA diseñados y validados para el análisis de un gran número de genes. Nuestro laboratorio realiza los análisis de MLPA siguiendo las recomendaciones descritas en: http://www.MLPA.com para, posteriormente analizar, mediante electroforesis capilar en un secuenciador automático, modelo ABI 3730XL los resultados de la amplificación de fragmentos de ADN.